尿調(diào)蛋白（uromodulin）又稱為Tamm-Horsfall蛋白，最早于1950年由Tamm和Horsfall于尿中發(fā)現(xiàn)，是尿液中含量最豐富的蛋白質(zhì)，由腎小管髓袢升支粗段的上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，經(jīng)過高爾基體的加工，分泌到腎小管上皮細(xì)胞管腔面的細(xì)胞膜上，部分進(jìn)入尿液，成為構(gòu)成管型的重要成分。既往的研究證實(shí)尿調(diào)蛋白與腎結(jié)石和泌尿系感染有關(guān)，近幾年研究提示尿調(diào)蛋白在慢性腎病中可能發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，尿尿調(diào)蛋白的水平與人群中慢性腎病的發(fā)生密切相關(guān)，可能有助于IgA腎病的診斷，因此，建立實(shí)用、可靠的檢測(cè)尿尿調(diào)蛋白的方法非常迫切。文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法操作繁瑣、所需時(shí)間長、有放射性污染，對(duì)于大樣本人群檢測(cè)受到限制。本研究建立了針對(duì)尿調(diào)蛋白的簡便、快速的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA）測(cè)定方法，同時(shí)對(duì)IgA腎病患者進(jìn)行了尿尿調(diào)蛋白的檢測(cè)，探討IgA腎病中尿尿調(diào)蛋白含量的變化。  

　　1資料與方法
　　1.1材料  
　　正常人尿樣：取腎功能正常、尿常規(guī)檢查陰性的正常人所留取的尿液標(biāo)本，共48例，男27例，女21例，平均年齡（32.8±1.3）歲，估計(jì)腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）為(102.3±3.69) mL/min/1.73 m2，留清晨第1次尿液，離心后-80 ℃保存。 
　　IgA腎病患者：選擇北京大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎穿刺確診為IgA腎病的住院患者166例，除外合并妊娠、泌尿系感染、糖尿病、腫瘤、肝硬化、過敏性紫癜、痛風(fēng)和腎結(jié)石的患者�；颊叩哪挲g(31.5±0.9)歲，男84例，女82例，eGFR為(101.83±1.04) mL/min/1.73 m2。于腎穿刺當(dāng)日留取清晨第1次尿液，離心后-80 ℃保存。 

　　1.2試劑：本研究應(yīng)用的主要試劑有兔抗人尿調(diào)蛋白多克隆抗體，小鼠抗人尿調(diào)蛋白單克隆抗體，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，牛血清白蛋白，尿調(diào)蛋白校準(zhǔn)品，尿調(diào)蛋白檢測(cè)試劑盒

　　1.3免疫組織化學(xué)染色：取腎腫瘤切除手術(shù)時(shí)留取的正常腎組織，經(jīng)石蠟固定后切片，厚4m，進(jìn)行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色，分別以兔抗人尿調(diào)蛋白多克隆抗體和小鼠抗人尿調(diào)蛋白單克隆抗體作為一抗。

　　1.4ELISA方法的建立 
　　多抗包被：用0.1 mol/mL pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋兔抗人尿調(diào)蛋白多克隆抗體，酶標(biāo)板100 ?L/孔，37 ℃孵育1 h，0.1%（體積分?jǐn)?shù)）Tween-0.01 mol/L pH 7.4 的PBS液(即PBST)洗3次，置于-80℃?zhèn)溆谩?nbsp;
　　封閉：3%牛血清白蛋白（BSA，0.05 mol/L PBS稀釋）室溫封閉1 h，PBST洗3次。 
　　加樣：Uromodulin標(biāo)準(zhǔn)品從12.5ng/ml開始對(duì)比稀釋，尿液標(biāo)本以TEA（0.5% Triton X-100 和20mMEDTA, pH 7.5,）1:200─4000稀釋，100ul/孔,37℃孵育2小時(shí)， PBST洗3次； 
　　檢測(cè)抗體：小鼠抗人尿調(diào)蛋白單克隆抗體用PBST稀釋，100ul/孔37℃孵育1小時(shí)，PBST洗3次； 
　　酶標(biāo)抗體：辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 1: 5000稀釋，100ul/孔37℃孵育0.5小時(shí)，PBST洗3次； 
　　顯色：TMB顯色，酶聯(lián)檢測(cè)儀上讀數(shù)。 
　　數(shù)據(jù)處理：以uromodulin校準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)r值在0.99以上方可使用。 
　　批內(nèi)精密度：相同標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)20次，其值的變化算出實(shí)驗(yàn)內(nèi)的變異系數(shù)。 批間精密度：不同日期、相同標(biāo)本測(cè)出的uromodulin數(shù)值之間的變異系數(shù)。

　　1.5尿肌酐檢測(cè)方法：相關(guān)標(biāo)本尿肌酐檢測(cè)采用堿性苦味酸法，用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)

　　1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，描述性數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。尿調(diào)蛋白商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果與本方法檢測(cè)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)相關(guān)分析，尿尿調(diào)蛋白和IgA腎病的相關(guān)性采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果 
　　2.1抗體結(jié)合特異：使用尿調(diào)蛋白單克隆抗體和多克隆抗體進(jìn)行腎組織的免疫組化染色，可看到尿調(diào)蛋白特異地表達(dá)在部分腎小管上皮細(xì)胞，尿調(diào)蛋白特異地分布在腎小管髓袢及遠(yuǎn)曲小管。

　　2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：經(jīng)方陣滴定，得到的最適條件為：多克隆抗體1:4 000以0.1 mol/mL pH 9.6碳酸鹽緩沖液稀釋、包板；單克隆抗體1:500以PBST稀釋；校準(zhǔn)品及尿液標(biāo)本以TEA（即0.5% Triton X-100和20 mmol/L EDTA, pH 7.5）稀釋，校準(zhǔn)品曲線范圍為0.78~12.5 ?g/L。 

　　2.3精確性與重復(fù)性 20份樣本的批內(nèi)精密度為7.5%，5份樣本（其值分別為3.5、11.8、23.6、33.4、39.3 mg/L）測(cè)定3次的批間精密度為7.9%。

　　2.4商品化試劑盒與本實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果比對(duì)：55例不同濃度的標(biāo)本商品化試劑盒和本研究所建立的試驗(yàn)方法同時(shí)檢測(cè)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)為r=0.615，P<0.001。

　　2.5IgA腎病患者尿尿調(diào)蛋白/尿肌酐的相關(guān)性：采用尿尿調(diào)蛋白/尿肌酐代表尿調(diào)蛋白的腎臟排泄。ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患者的尿尿調(diào)蛋白/尿肌酐比值為(3.52±0.59) mg/g (n=166)，明顯低于正常人[(18.39±3.46) mg/g, n=48, P<0.001]。 

　　3討論：建立本實(shí)驗(yàn)方法的關(guān)鍵是要有與uromodulin特異性結(jié)合的抗體。在正常腎組織上進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗(yàn)顯示，陽性部位均表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞腔膜面，可以證實(shí)兩種抗體均為高特異性抗uromodulin抗體，符合實(shí)驗(yàn)要求。 
　　經(jīng)過多次對(duì)試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)的最適條件為：多克隆抗體以1:4 000包板，單克隆抗體以1:500作為檢測(cè)抗體，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性可以達(dá)到0.99以上，最低檢出限為0.1 mg/L，完全可以滿足科研工作的要求。20份標(biāo)本的室內(nèi)變異系數(shù)為7.5%，表明實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性是令人滿意的。盡管ELISA的影響因素很多，但是相同樣本在不同日期的3次檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)為7.9%，小于15%，說明本方法穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好。 
　　與商品化試劑盒相比，相同標(biāo)本在不同檢測(cè)體系所得結(jié)果具有高度相關(guān)性，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所建立的方法可以應(yīng)用于尿液中uromodulin的檢測(cè)。