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計算機(jī)模擬離子色譜線性梯度淋洗分離陰離子

[2013/2/22]

  1引言

  用離子色譜法適合于分析無機(jī)、有機(jī)陰離子。梯度淋洗是快速、靈敏分析強(qiáng)保留離子和弱保留離子混合物的有效方法。但梯度淋洗的條件的摸索卻相當(dāng)費時,如果能創(chuàng)建計算機(jī)模擬程序,先根據(jù)樣品的組成,對要分析的樣品進(jìn)行模擬分離,得出大致條件,再通過實驗進(jìn)行適當(dāng)校正,能大大提高工作效率。實現(xiàn)離子色譜線性梯度條件下分離陰離子的計算機(jī)模擬的關(guān)鍵是梯度條件下陰離子保留值的預(yù)測和離子色譜峰峰形的預(yù)測。Madden等[1]研究了用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificialneuralnetwork)對離子色譜線性梯度條件下分離陰離子的保留值的預(yù)測。該方法用一系列不同的梯度淋洗的實驗數(shù)據(jù)對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練,從而使此系統(tǒng)有預(yù)測智能。國外一些學(xué)者在經(jīng)典離子交換色譜梯度淋洗分離蛋白質(zhì)保留值的預(yù)測方面進(jìn)行了很多工作[2~4]。國內(nèi)尚未見在梯度條件下陰離子保留值的預(yù)測和離子色譜模擬分離方面工作的報道。人們在反相液相色譜梯度條件下組分保留值的預(yù)測方面也做了大量的工作[5~7]。

  本實驗使用DionexAS18陰離子分離拄,用NaOH淋洗液,研究了在梯度淋洗過程中不同時間組分質(zhì)點在離子色譜柱中的位置,及所在時間和位置的淋洗液濃度,得出所在時間和位置的容量因子,從而得出組分所在時間和位置的遷移速度,通過積分得出保留時間。再根據(jù)離子色譜峰峰形變化的規(guī)律,得到色譜峰峰形的有關(guān)參數(shù),編程進(jìn)行模擬分離,得到了保留時間與峰形與實驗非常接近的色譜圖。

  2理論

  2.1等度淋洗保留模型

  梯度淋洗保留值的數(shù)學(xué)模型是建立在等度淋洗的數(shù)學(xué)模型基礎(chǔ)上的。使用NaOH作為淋洗液時,常用實驗節(jié)點模型(EEPM)[8]預(yù)測保留值,陰離子容量因子k和NaOH濃度關(guān)系如下:lgk=C1 C2lg[OH-](1)通過實驗數(shù)據(jù)可以求出待定系數(shù)C1和C2。

  還有一個模型稱為DryLab模型[9],此模型在EEPM基礎(chǔ)上加了一個二次項校正:lgk=C1 C2lg[OH-]+C3(lg[OH])2(2)Madden等[9]的研究證明,用DryLab模型對一些極弱有機(jī)酸陰離子和磷酸根等離子的誤差更小。

  由于EEPM模型預(yù)測較簡單又較準(zhǔn)確,對于大多數(shù)陰離子,則采用EEPM模型預(yù)測;對于磷酸根、砷酸根等陰離子,則采用DryLab模型。

  2.2梯度淋洗的保留值的數(shù)學(xué)模型

  2.2.1初始等度運行階段梯度程序開始有時有一段等度運行時間t0,此時整個色譜柱,淋洗液的濃度均為初始濃度。如果用EEPM模型,此時組分質(zhì)點的遷移速度為:v=v0k0 1=v0exp(C1 C2lg[OH-]0)+1(3)其中v為組分質(zhì)點的遷移速度,v0為淋洗液質(zhì)點的遷移速度,[OH-]0為淋洗液的初始濃度。

  2.2.2淋洗液的濃度開始增加到停止增加階段等度運行時間t0過后,淋洗液濃度開始升高。對于低壓梯度色譜系統(tǒng),淋洗液濃度的升高是從比例閥開始的,經(jīng)過壓力傳感器、泵頭、梯度混合器及管路到進(jìn)樣環(huán)、到色譜柱頭,需要一段時間,這段時間稱之為儀器滯后時間[5,6]。該滯后時間對等度淋洗不會產(chǎn)生絲毫影響,但使得梯度淋洗液的濃度變化延時。初始時間后到初始時間加儀器滯后時間范圍內(nèi),雖然比例閥處淋洗液濃度已在升高,但整個色譜柱內(nèi),淋洗液的濃度仍為初始濃度,此時組分質(zhì)點的遷移速度仍為(3)式。初始等度運行時間加儀器滯后時間,在色譜柱柱頭,淋洗液的濃度開始上升。但由于前一段時間的等度淋洗,組分質(zhì)點已遷移了一段距離,在組分質(zhì)點處,在濃度開始增加的淋洗液質(zhì)點追上組分質(zhì)點前,淋洗液的濃度仍為初始濃度,此時組分質(zhì)點的遷移速度仍為(3)式。

  再經(jīng)過一段時間,濃度開始增加的淋洗液質(zhì)點追上組分質(zhì)點,從此時到淋洗液濃度停止增加,組分質(zhì)點位置的淋洗液的濃度為:[OH-]=[OH-]0+(t-td-t0-t1)S(4)其中t為從進(jìn)樣到此時的時間,td為儀器滯后時間,t0為初始等度運行時間,t1為淋洗液質(zhì)點從柱頭到追上組分質(zhì)點所需要的時間。s為單位時間淋洗液濃度的增加值。此時組分質(zhì)點的遷移速度為:v=v0[]k0 1=v0exp{C1+C2lg[[OH-]0+(t-td-t0-t1)S]}+1(5)2.2.3淋洗液的濃度上升停止階段淋洗液濃度停止增加后的開始階段,濃度停止增加的淋洗液質(zhì)點還沒有追上組分質(zhì)點。在組分質(zhì)點位置處,淋洗液濃度還在繼續(xù)增加,組分質(zhì)點位置的淋洗液的濃度仍然為(4)式,此時組分質(zhì)點的遷移速度仍然為(5)式。

  一段時間后,濃度停止增加的淋洗液質(zhì)點追上組分質(zhì)點,則組分質(zhì)點位置的淋洗液的濃度為此階梯度的淋洗液最終濃度。此時組分質(zhì)點的遷移速度為:v=v0k 1=v0C1 C2lg[OH-]f+1(6)[OH-]f為此階梯度的淋洗液最終濃度。則一階離子色譜線性梯度條件下組分離子保留時間為:tR=l1vi+∫l20dlv+l3vf=l1+l3v0/[exp(C1 C2lg[OH-]0)]+1+∫l20dlv0/[exp(C1 C2lg[OH-]0)](7)其中vi為初始等度淋洗階段組分離子的遷移速度,l1為在此遷移速度下組分的遷移的距離,l2為在梯度淋洗條件下組分變速遷移的距離,vf為淋洗液的濃度為最終濃度階段組分離子的遷移速度,l3為在此遷移速度下遷移的距離。需要注意的是,這里梯度淋洗階段和最終濃度階段,是針對組分所處的位置的淋洗液的濃度而言,滯后于梯度程序的梯度淋洗階段和最終濃度階段。

  3實驗部分

  3.1儀器和試劑

  離子色譜儀系統(tǒng),配有梯度泵、柱溫箱、脫氣裝置、電導(dǎo)檢測器、(2mm)電導(dǎo)抑制器、電腦配色譜工作站及BorlandDelphi7.0程序設(shè)計語言。實驗所用的甲酸、NaCl,NaNO3等試劑均為分析純試劑。

  3.2色譜柱和流動相

  以濃度為50%的NaOH溶液配制淋洗液。用去離子水將分析純試劑甲酸、氯化鈉,亞硝酸鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、磷酸鈉、碘化鉀、檸檬酸三鈉配制成濃度為200mg/L的儲備液,使用前將其稀釋成濃度為2~10mg/L的溶液。所用水為去離子水,其電阻率大于10MΩ?cm。

  IonPacAG18陰離子保護(hù)柱(50mm×2mmi.d.),IonPacAS18陰離子分離柱(250mm×2mmi.d.)。柱溫:30℃。以NaOH溶液作為淋洗液,由去離子水和NaOH溶液組二元梯度淋洗系統(tǒng)。A為去離子水;B濃度為100mmol/L的NaOH溶液。淋洗液流速:0.25mL/min。

  3.3儀器滯后時間td和死時間tM的測定

  將離子色譜保護(hù)柱柱頭的淋洗液管路斷開,開泵用100%的去離子水的沖洗。將壓力傳感器、泵頭、梯度混合器及管路到進(jìn)樣環(huán)里面的NaOH沖洗干凈后(通過測流出液的pH值),開始輸送NaOH溶液,流速為0.25mL/min。從這時起到進(jìn)樣環(huán)流出液為堿性,這段時間即為儀器滯后時間td。在此色譜條件下,測得td=3.75min。以去離子水的負(fù)峰的出峰時間作為死時間,測得tM=2.95min。

  4結(jié)果與討論

  4.1不同陰離子容量因子的對數(shù)與淋洗液濃度的對數(shù)的關(guān)系

  對于所研究的每一種陰離子,通過測得的7~10個不同淋洗液濃度條件下的保留時間,算出在不同淋洗液濃度條件下的容量因子。通過一元線性回歸(用EEPM模型)或二次多項式回歸(用DryLab模型)處理,得到不同陰離子容量因子的對數(shù)與淋洗液濃度的對數(shù)的關(guān)系的回歸方程(見表1)。將不同陰離子的回歸方程的C1、C2和C3存入數(shù)據(jù)庫,模擬時調(diào)用。對于絕大多數(shù)陰離子,用EEPM模型就能準(zhǔn)確地描敘陰離子容量因子的對數(shù)與淋洗液濃度的對數(shù)的關(guān)系。但對于磷酸根這樣的末級電離常數(shù)非常小的陰離子,用DryLab模型較好[8]。

  4.2計算機(jī)模擬程序

  設(shè)計一Delphi程序,模擬用NaOH淋洗液梯度淋洗分離不同的陰離子。程序運行后,選擇梯度淋洗的色譜條件,選擇模擬分離的陰離子及濃度。模擬進(jìn)樣后,程序根據(jù)選擇的數(shù)據(jù),從數(shù)據(jù)庫中調(diào)出不同的陰離子的容量因子隨淋洗液濃度變化關(guān)系數(shù)據(jù),運用前面所述的數(shù)學(xué)模型,算出各時刻陰離子質(zhì)點所在位置的淋洗液濃度、對應(yīng)的容量因子、遷移速度、保留時間。色譜圖用修改的高斯曲線模型EMG曲線模型[9,10]模擬。通過實驗、數(shù)據(jù)處理后得到不同的陰離子在等度淋洗及梯度淋洗條件下的EMG參數(shù)隨保留值變化的速率,存入數(shù)據(jù)庫,模擬時調(diào)用。梯度淋洗時EMG參數(shù)σ、τ隨保留值增加的速率較慢,從而模擬得到較窄的色譜峰;漂移的模擬是根據(jù)實際每分鐘漂移的信號的大小,將漂移值疊加到修改的高斯曲線中;的噪音通過將隨機(jī)函數(shù)值疊加到修改的高斯曲線進(jìn)行模擬。

  4.3模擬結(jié)果及討論

  圖1A和圖1B分別為2種不同的梯度程序淋洗甲酸根、Cl、NO-2、SO2-4、NO-3、PO3-4、檸檬酸根和I-的色譜圖和模擬色譜圖。表2為這些陰離子在這2種梯度淋洗條件下保留值的預(yù)測值誤差的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。梯度淋洗程序1為比較平緩的線性梯度,條件為:開始時淋洗液濃度從32mmol/L線性上升,15min后升高到80mmol/L,保持5min后回到初始濃度。梯度淋洗程序2為比較陡峭的線性梯度,條件為:開始有4min的淋洗液濃度為28mmol/L的等度淋洗,4min后淋洗液濃度開始線性上升,上升1min后升高到100mmol/L,保持15min后回到初始濃度,此梯度接近于一臺階梯度。

  圖1中甲酸根、Cl-和NO-2實際是等度淋洗出色譜柱的。因為儀器在此條件下有3.75min的滯后時間,濃度升高的淋洗液還沒有到達(dá)色譜柱頭,甲酸根已流出色譜柱。雖然Cl-和NO-2的保留時間大于儀器的滯后時間,但濃度升高的淋洗液到達(dá)色譜柱頭時,Cl-和NO-2已快流出色譜柱,濃度升高的淋洗液還未追上Cl-,Cl-和NO-2已流出色譜柱。同理,由于有4min的等度淋洗,圖1B中除了甲酸根、Cl-、NO-2外,SO2-4也是等度淋洗出色譜柱的。

  A.程序1――平緩線性梯度(gradientelutionprofile1:mildlineargradient);B.程序2――陡峭線性梯度(gradientelutionprofile2:steeplineargradient)。1.HCOO-;2.Cl-;3.NO-2;4.SO2-4;5.NO-3;6.PO3-4;7.檸檬酸根(citrate);8.I-。

  從表2可以看出,此程序模擬離子色譜梯度淋洗陰離子,無論是比較平緩的線性梯度還是接近于臺階梯度的線性梯度,模擬色譜圖的保留時間是比較準(zhǔn)確的,最大相對誤差小于5%。

  離子色譜梯度淋洗陰離子色譜峰峰形的變化規(guī)律比較復(fù)雜。對于比較平緩的線性梯度(如圖1A)。變化規(guī)律比較簡單,基本上符合色譜峰的EMG參數(shù)σ(標(biāo)準(zhǔn)偏差)、τ(指數(shù)衰減時間常數(shù))隨保留時間線性變化的規(guī)律[11],圖1A(b)就是基于這種數(shù)學(xué)模型模擬的結(jié)果。與圖1A(a)進(jìn)行比較,色譜峰峰形非常接近。對于臺階梯度和比較陡的線性梯度,色譜峰峰形的變化規(guī)律相當(dāng)復(fù)雜,臺階梯度和比較陡的線性梯度的色譜圖一般有一個陡坡,一般來說,在靠近陡坡頂出峰的色譜峰,色譜峰比較窄。在有些情況下,色譜峰特別窄(如圖1B),保留時間較長的檸檬酸根的色譜峰還大大窄于保留時間較短的SO24、NO-2的色譜峰。用此峰來計算色譜柱柱效,柱效離奇的高(色譜工作站顯示用檸檬酸根的色譜峰計算色譜柱柱效高達(dá)36401理論塔板數(shù),其半蜂寬大大低于保留時間較短的SO2-4、NO-2、PO3-4的保留時間)。有關(guān)機(jī)理非常復(fù)雜,Enlund等[12]對色譜和毛細(xì)管電泳出現(xiàn)的柱效奇高的現(xiàn)象進(jìn)行了探討。本研究模擬時,也考慮了這一點。圖1B(b)為在圖1B(a)條件下的模擬色譜圖,模擬色譜圖與真實色譜圖的峰形非常接近。

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