微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過(guò)程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。

　　低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。

　　一、保藏方法大致可分為以下幾種：

　　1.傳代培養(yǎng)保藏法

　　又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等(后者作保藏厭氧細(xì)菌用)，培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存。

　　2.液體石蠟覆蓋保藏法

　　是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。

　　3.載體保藏法

　　是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。

　　4.寄主保藏法

　　用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。

　　5.冷凍保藏法

　　可分低溫冰箱(-20—-30℃，-50—-80℃)、干冰酒精快速凍結(jié)(約-70℃)和液氮(-196℃)等保藏法。

　　6.冷凍干燥保藏法

　　先使微生物在極低溫度(-70℃左右)下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分(真空干燥)。

　　有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來(lái)制備細(xì)胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對(duì)細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過(guò)氫和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。保護(hù)劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。

　　二、器材:　　細(xì)菌、酵母菌，放線菌和霉菌;

　　肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學(xué)純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95%酒精，10%鹽酸，無(wú)水氯化鈣;

　　滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管(長(zhǎng)頸球形底)，40目與 100目篩子，油紙，濾紙條(0.5×1.2cm)，干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱(-30℃)，液氮冷凍保藏器。

　　三、操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)

　　下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做。

　　1.斜面低溫保藏法

　　將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長(zhǎng)后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

　　保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2—4個(gè)月，移種一次。酵母菌兩個(gè)月，細(xì)菌最好每月移種一次。

　　此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀;污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多。

　　2.液體石蠟保藏法

　　(1)將液體石蠟分裝于三角燒瓶?jī)?nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。

　　(2)將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。

　　(3)用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)(圖Ⅶ-12)，使菌種與空氣隔絕。

　　(4)將試管直立，置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長(zhǎng))。

　　此法實(shí)用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般無(wú)芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個(gè)月之久。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種。缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。

　　3.濾紙保藏法

　　(1)將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0.6×8cm的安瓿管中，每管1—2張，塞以棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌30分鐘。

　　(2)將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長(zhǎng)。

　　(3)取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。

　　(4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

　　(5)將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。

　　(6)將棉花塞入管內(nèi)，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存于低溫下。

　　(7)需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。

　　細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14—17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)備。

　　4.沙土保藏法

　　(1)取河沙加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。

　　(2)倒去酸水，用自來(lái)水沖洗至中性。

　　(3)烘干，用40目篩子過(guò)篩，以去掉粗顆粒，備用。

　　(4)另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。

　　(5)烘干，碾碎，通過(guò)100目篩子過(guò)篩，以去除粗顆粒。

　　(6)按一份黃土、三份沙的比例(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌，烘干。

　　(7)抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無(wú)菌試驗(yàn)，直至證明無(wú)菌，方可備用。

　　(8)選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長(zhǎng)豐滿的，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種，以無(wú)菌水洗下，制成孢子懸液。

　　(9)于每支沙土管中加入約0.5ml(一般以剛剛使沙土潤(rùn)濕為宜)孢子懸液，以接種針拌勻。

　　(10)放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時(shí)間越短越好，務(wù)使在12小時(shí)內(nèi)抽干。

　　(11)每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況和有無(wú)雜菌生長(zhǎng)，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長(zhǎng)，則說(shuō)明制作的沙土管有問(wèn)題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。

　　(12)若經(jīng)檢查沒(méi)有問(wèn)題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。

　　(13)需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。

　　此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。

　　5.液氮冷凍保藏法

　　(1)準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液體的。

　　(2)加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒(méi)以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌15分鐘。

　　(3)接入菌種將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無(wú)漏洞。

　　(4)凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。

　　(5)保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器(圖Ⅶ-14)的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。

　　(6)恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

　　此法除適宜于一般微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長(zhǎng)期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。

　　6.冷凍干燥保藏法

　　(1)準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長(zhǎng)頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管(圖Ⅶ-15)，大小要求外徑6—7.5mm，長(zhǎng)105mm，球部直徑9—11mm，壁厚0.6—1.2mm。也可用沒(méi)有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌30分鐘，備用。

　　(2)準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，若用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24—48小時(shí)的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng)3天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天。

　　(3)制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2ml。

　　(4)冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡(jiǎn)易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。

　　將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無(wú)低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2>)酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。

　　(5)真空干燥為在真空干燥時(shí)使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶?jī)?nèi)。

　　抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93.3Pa(0.7mmHg)真空度時(shí)，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時(shí)內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg)，保持壓力6—8小時(shí)即可。

　　(6)封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管(圖Ⅶ-17)繼續(xù)抽氣，約10分鐘即可達(dá)到26.7Pa(0.2mmHg)。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中央進(jìn)行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。

　　此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對(duì)一般生活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無(wú)芽胞菌都適用，即使對(duì)一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長(zhǎng)期保存，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。